Персонализированный подход к терапии неонатального сахарного диабета в зависимости от генетического дефекта

ВВЕДЕНИЕ

Термин «неонатальный сахарный диабет» (НСД) в настоящее время включает группу гетерогенных по этиопатогенезу и клинической картине заболеваний, сопровождающихся стойкой (более 2 нед) гипергликемией у детей первых 6 мес жизни [1, 2].

В 50% случаев НСД является транзиторным (ТНСД) с развитием ремиссии в течение первых месяцев жизни пациента, в остальных случаях отмечается перманентное течение НСД (ПНСД) [3].

К наиболее частым причинам ПНСД относят функциональные дефекты β-клеток в результате мутаций в генах KCNJ11, ABCC8 [4–6], а также преждевременный апоптоз β-клеток вследствие дефекта гена INS [7].

У 25% пациентов с мутациями в гене KCNJ11 [6, 8], а также у некоторых пациентов с мутациями в гене АВСС8 [9] течение НСД осложняется неврологической симптоматикой в виде эпилепсии, выраженной задержки психомоторного и речевого развития, мышечной гипотонии – DEND-синдром.

Также описаны пациенты с промежуточным фенотипом – intermediate DEND (iDEND), характеризующимся умеренной

задержкой моторного и речевого развития и отсутствием очагов эпилептической активности на электроэнцефалограмме (ЭЭГ) [6].

Лабильное течение СД у детей первых месяцев жизни, отсутствие четкой корреляции генотип-фенотип, высокая стоимость лечения, а также потенциальный риск развития тяжелых сосудистых осложнений уже к моменту достижения пациентом периода полового созревания требуют поиска принципиально новых подходов к диагностике и лечению данной патологии.

В настоящей статье приведены результаты генетического обследования 70 пациентов с НСД, обобщен опыт использования производных сульфонилмочевины (ПС) у пациентов с мутациями в генах KCNJ11 и АВCС8 за период с 2009 по 2016 гг. Показана корреляция между типом мутации, течением заболевания и чувствительностью пациентов к ПС.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Продемонстрировать принципы персонализированной терапии НСД в зависимости от типа мутации в генах АТФ-зависимых К-каналов.

МЕТОДЫ

В исследование были включены 70 пациентов (43 мальчика, 27 девочек) в возрасте от 1 мес до 25 лет с манифестацией СД от 0 до 6 мес жизни.

Информированное согласие об участии в исследовании было подписано родителями всех пациентов. Протокол исследования был одобрен в локальном этическом комитете (протокол № 22 от 29.10.2009 года; ФГБУ Эндокринологический научный центр Минздрава России).

25 пациентов (35,7%) проживали в Москве и Московской области, 45 детей (64,3%) были направлены из регионов. Медиана возраста манифестации СД составила 58,5 дня жизни [2; 180]. Медиана возраста проведения генетического обследования составила 4,5 мес жизни [3; 58].

Семейный анамнез по НСД был отягощен у 6/70 пациентов (8,5%). Один ребенок был рожден от близкородственного брака.

На момент проведения генетического обследования у 9 пациентов отмечалась ремиссия СД, остальные пациенты (n=61) находились на инсулинотерапии по базис-болюсной схеме (среди них у 3 пациентов отмечался рецидив ТНСД). В дальнейшем развитие ремиссии заболевания отмечалось еще в 9 случаях.

У большинства пациентов, включенных в исследование, отмечалось изолированное нарушение углеводного обмена (52/70, 74%). Сопутствующая патология была зарегистрирована у 18/70 (26%) пациентов. Среди них у 13/18 (72%) пациентов – неврологические нарушения (эпилепсия, задержка моторного и психоречевого развития), в 2/18 (11%) случаях – врожденный порок сердца (ВПС) (стеноз легочной артерии, дефект межжелудочковой перегородки (ДМЖП), открытое овальное окно (ООО)), в 1 случае – дефект передней брюшной стенки.

У 2 пациентов на основании клинической картины были заподозрены синдромальные формы НСД. В одном случае была выявлена гипоплазия поджелудочной железы (ПЖ) в сочетании с ВПС и аплазией желчного пузыря, что позволило предположить течение синдрома Митчелла-Релея. У другого ребенка с ПНСД, ихтиозом и энтеропатией клинически был заподозрен IPEX-синдром.

В период с 2009 по 2013 гг. всем пациентам с НСД первоначально проводилось секвенирование гена KCNJ11 методом Сэнгера. При отсутствии мутаций проводилось исследование генов INS и АВСС8.

В соответствии с фенотипом пациенту с подозрением на IPEX-синдром было проведено секвенирование гена FOXP3, пациенту с клиникой синдрома Митчелла-Релея –исследование гена RFX6.

Всем пациентам с НСД, направленным на генетическое исследование с 2013 по 2016 гг., а также пациентам без мутаций в генах KCNJ11, ABCC8 и INS было проведено высокопроизводительное параллельное секвенирование на секвенаторе PGM, Ion Torrent (Life Technologies, США).

Молекулярно-генетические исследования

Геномную ДНК выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов.

Секвенирование по Сэнгеру проводили на автоматическом секвенаторе ABI Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems, США).

Для высокопроизводительного параллельного секвенирования использовалась библиотека ампликонов, полученная в результате мультиплексной ПЦР с использованием панели Custom Ion AmpliSeq (Life Technologies, США), включавшей праймеры для амплификации 28 генов, ассоциированных с наследственными вариантами сахарного диабета и врожденного гиперинсулинизма.

Панель исследуемых генов включала: GCG, GLUD1, WFS1, HNF1A, GCK, INS, HNF1B, ABCC8, HNF4A, RFX6, PTF1A, NEUROD1, AKT2, ZFP57, INSR, EIF2AK3, PPARG, PAX4, PDX1, GLIS3, KCNJ11, SLC16A1, FOXP3, BLK, CEL, KLF11, SCHAD, GCGR.

Секвенирование проводилось на секвенаторе PGM, Ion Torrent (Life Technologies, США).

Не описанные ранее несинонимичные мутации считались «возможно патогенными» при частоте минорного аллеля <1% и «патогенной» оценке по базе данных ANNOVAR. Все выявленные мутации и полиморфизмы были подтверждены методом Сэнгера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Наличие генетического дефекта было подтверждено у 50/70 пациентов (71%): у 7/21 (33%) пациентов с ТНСД и у 43/49 (87%) пациентов с ПНСД.

У 44 пациентов мутации возникли de novo, в 6 случаях были унаследованы от одного из родителей с СД. 14 мутаций ранее не были описаны.

Подавляющее большинство мутаций было найдено в гене KCNJ11 (n=32/50, 64%): у 2 пациентов с ТНСД, у 24 пациентов с ПНСД и 6 пациентов с iDEND и DEND-синдромом. Из них в 31 случае – гетерозиготные миссенс-мутации, в одном случае была найдена делеция фрагмента гена KCNJ11 (V231_Q235delVPLHQ) без нарушения рамки считывания.

Наиболее часто встречались мутации: R201H (выявлена у 12 пациентов с ПНСД), R201C – у 2 пациентов с ПНСД и 1 пациента с iDEND, V59M – у 1 ребенка с ПНСД и 1 ребенка с iDEND. Новая мутация V64M была найдена у 2 пациентов с DEND-синдромом.

Гетерозиготные миссенс-мутации в гене АВСС8 были выявлены у 2 пациентов с ПНСД и 1 пациентки с ТНСД. Мутации D212G и Y798C ранее не были описаны.

Гетерозиготные мутации в гене INS были выявлены у 5/43 пациентов с ПНСД (11,6%).

У 3 пациентов по данным генетического обследования были диагностированы синдромальные формы НСД: IPEX-синдром, синдром Донахью и синдром Уолкотта-Раллисона. Причем у пациента с синдромом Уолкотта-Раллисона генетический диагноз был установлен до появления сопутствующих симптомов заболевания.

У двух пациентов были выявлены сочетанные гетерозиготные мутации в двух генах-кандидатах НСД и МОДИ: N605H/HNF1A и I28V/GLIS у одной пациентки и G32S/ INS и C261Х/ZFP57 во втором случае.

После генетической верификации диагноза 22/35 (65,7%) пациента с мутациями в генах АТФ-зависимых К-каналов (из них 19 пациентов с мутациями в гене KCNJ11 и 3 пациента с дефектом гена АВСС8) были полностью переведены с инсулинотерапии на терапию глибенкламидом. Медиана возраста перевода на глибенкламид составила 3,5 мес [2; 21], медиана суточной дозы инсулина перед переводом – 1,0 ед/кг/сут [0,9; 1,0]. Стартовая доза глибенкламида у всех пациентов составила 0,1 мг/кг/сут. Титрование дозы глибенкламида проводилось с шагом 0,1 мг/кг/сут до достижения целевых показателей гликемии. Одновременно проводилось снижение суточной дозы инсулина короткого и пролонгированного действия.

При этом медиана суточной потребности в глибенкламиде у детей первого года жизни с изолированным нарушением углеводного обмена составила 0,3 мг/кг [0,15; 0,55]. Высокая потребность в глибенкламиде 1,1 мг/кг/сут [1,0; 1,65] отмечалась у пациентов с сопутствующей неврологической патологией (iDEND-синдром), а также со стажным течением НСД.

Максимальная суточная доза глибенкламида у наших пациентов составила 2,0 мг/кг, что согласуется с зарубежными исследованиями.

Медиана длительности перевода на глибенкламид составила 7 дней [5; 8]. Максимальная продолжительность перевода у пациентки 6 лет с iDEND-синдромом в результате мутации V59M/KCNJ11 cоставила 24 дня.

Нежелательные побочные явления, связанные с приемом препарата, зарегистрированы не были.

В одном случае была назначена комбинированная терапия глибенкламидом в дозе 1,8 мг/кг/сут в сочетании с инсулином пролонгированного действия (Гларгин) в суточной дозе 0,6 ед/кг.

4/32 пациента (12,5%) с мутациями в гене KCNJ11 (V64M (n=2), G334D, L164P) оказались резистентными к терапии глибенкламидом, при этом в большинстве случаев наблюдалось течение DEND-синдрома. Четыре пациента с мутациями в гене KCNJ11 от модификации лечения воздержались. В 2 случаях ожидается плановая госпитализация.

Динамическое наблюдение за пациентами после перевода на глибенкламид осуществлялось спустя 3, 6, 12 мес от момента назначения препарата (далее ежегодно), медиана длительности периода наблюдения составила 34,9 мес [17–41]. Максимальный период наблюдения составил 7 лет.

Сразу после перевода у всех пациентов отмечалось значительное улучшение показателей гликемического профиля без увеличения клинически значимых гипогликемий, что было подтверждено данными суточного мониторирования гликемии.

Через 3 мес от момента перевода у всех пациентов было отмечено снижение уровня гликированного гемоглобина (HbA1c) на фоне повышения уровня базального С-пептида. Медиана уровня HbA1c до перевода составила 8,3% [7,3; 8,5], через 3 мес от момента перевода – 6,1% [5,85–6,2]. Уровень базального С-пептида перед переводом был снижен до неопределяемых значений, через 3 мес после перевода медиана уровня базального С-пептида составила 0,9 нг/мл [0,8–1,0]. Кроме того, уже через 2 мес от модификации лечения у всех пациентов были отмечено значительное снижение суточной дозы глибенкламида. Через 1 год от момента перевода медиана поддерживающей дозы глибенкламида составила 0,07 мг/кг/сут [0,06; 0,1]. При этом сохранялось изначальное уменьшение уровня HbA1c и повышение уровня С-пептида.

В двух случаях спустя 2 мес от начала приема глибенкламида мы наблюдали развитие ремиссии заболевания (пациент с делецией V231_Q235del в гене KCNJ11 и пациентка с мутацией D212G в гене АВСС8).

ОБСУЖДЕНИЕ

Совершенствование методов молекулярно-генетического анализа на современном этапе открыло новые перспективы для диагностики и персонализированного подхода к терапии НСД.

В первую очередь это касается пациентов с мутациями в генах АТФ-зависимых К-каналов, большинство из которых могут быть успешно компенсированы на фоне лечения пероральными ПС [10, 11, 12].

Среди наших пациентов компенсация углеводного обмена на фоне монотерапии глибенкламидом была достигнута в 22/35 (65,7%) случаях. Важно отметить наличие ассоциации между локализацией мутации в гене KCNJ11, тяжестью клинических проявлений заболевания и чувствительностью пациентов к ПС [6]. Наиболее частыми мутациями в гене KCNJ11 являются замены аминокислотных остатков, участвующих в формировании АТФ-связывающего домена (binding site), что приводит к нарушению взаимодействия KIR6.2 субъединицы с АТФ («binding-mutation»). Для пациентов с мутациями такого типа характерны изолированное нарушение углеводного обмена и высокая чувствительность к CМ [6].

Для мутаций, расположенных в порообразующем регионе, в районе формирования «воротной петли» и в районе «скользящей спирали» («gating mutation») характерно наличие ПНСД, DEND/iDEND-синдрома в сочетании с низкой чувствительностью к глибенкламиду [6, 8].

Так, по нашим данным, высокая потребность в глибенкламиде отмечалась у пациентов с iDEND-синдромом в результате мутации V59M в гене KCNJ11, а попытка назначения препарата в максимально описанной дозировке (2 мг/кг/сут) пациентам с мутациями L164P, V64M и G334D привела к ухудшению показателей гликемии, в результате чего была назначена прежняя схема инсулинотерапии.

Кроме того, мы отметили повышение потребности в глибенкламиде у пациентов со стажным течением НСД.

Помимо пациентов с мутациями в генах АТФ-зависимых К-каналов, ранняя генетическая диагностика заболевания крайне важна для пациентов с синдромальной патологией, так как позволяет прогнозировать течение заболевания и появление дополнительной клинической симптоматики. В частности, выявление мутаций в гене FOXP3 необходимо для своевременного назначения патогенетической иммуносупрессивной терапии и решения вопроса о необходимости трансплантации костного мозга. Риск тяжелого поражения печени у пациентов с синдромом Уолкотта-Раллисона лимитирует применение потенциально гепатотоксичных лекарственных препаратов, а также оперативных и диагностических манипуляций под общей анестезией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время определение генетической причины заболевания является не только «золотым стандартом» диагностики НСД, но и важнейшим условием для персонализированного подхода к терапии таких больных, что в конечном итоге необходимо для успешной компенсации НСД с уменьшением инвазивности и стоимости лечения, а также для проведения медико-генетического консультирования в вопросах дальнейшего планирования семьи.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источники финансирования. Молекулярно-генетическое исследование было проведено при содействии Фонда поддержки и развития филантропии «КАФ».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с настоящей публикацией.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования – Ю.В. Тихонович, А.Н. Тюльпаков; сбор материала, анализ полученных данных – Н.А. Зубкова, Ю.В. Тихонович, А.Н. Тюльпаков; проведение молекулярно-генетического исследования – А.Н. Тюльпаков.